蔣介石發表關於國共合作談話，承認了中國共產黨的合法地位。至此，以第二次國共合作為基礎的民族統一戰線正式形成。

西安事變後，蔣介石被迫結束十年內戰，與共產黨實行第二次合作。1937年七七事變後，終於建立了國共合作抗日民族統一戰線，蔣介石積極部署和指揮中國軍隊開赴華北和淞滬前線，抗禦日本侵略軍,他先後指揮了淞滬會戰，太原會戰，徐州會戰，武漢會戰等重大戰役。廣大愛國將士奮勇殺敵，至1938年10月，使日軍傷亡45萬餘人，粉碎了日本帝國主義妄圖速戰速決、迅速滅亡中國的戰略計畫。蔣介石在政治民主化方面作出一些許諾，釋放政治犯，修改反動條例，召開國民參政會等，全國一時出現一片新氣象。但由於蔣介石實行片面抗戰路線和單純軍事防禦的戰略戰術，又幻想並等待國際“調停”制止日本侵略，因而不能抵禦占有很大優勢的日本侵略軍，華北、東南和華中大片國土相繼淪陷。
　　武漢保衛戰結束後，抗日戰爭由戰略防禦階段轉入戰略相持階段。蔣介石表示了繼續抗戰的決心，汪精衛等人則對抗戰前途完全失望，叛國投敵。1939年1月，蔣介石任國防最高委員會委員長。他對中國共產黨和人民武裝力量在抗戰中迅速發展壯大憂心忡忡，乃實行溶共、防共、限共、反共的方針，不斷製造反共摩擦。
　　1941年12月太平洋戰爭爆發後，蔣介石積極開展外交活動，與美、英同盟，任中國戰區最高統帥，得到了美國的物資和財政援助。他派中國遠征軍去緬甸，與英美聯軍聯合作戰，打通了中印公路。美、英為了聯合中國共同抗擊日本，許諾廢除不平等條約所規定的在華特權，簽訂了中美、中英“新約”。1943年11月，蔣介石出席開羅會議，與美國總統羅斯福、英國首相邱吉爾會談對日聯合作戰方略及戰後和平條件。1945年6月派宋子文等去蘇聯會談，8月兩國外長簽署了《中蘇友好同盟條約》及有關協定。